上海科学家发现遗传学新方法 可加速重要基因功能鉴定

2021-03-09 16:35:53 作者: 上海科学家发

东方网3月9日消息:小鼠和人类的听觉系统在发育和功能上十分相似,因此,利用小鼠模型筛查耳蜗听觉毛细胞发育过程中的重要基因,对于毛细胞再生和临床上寻找耳聋基因的治疗靶点有重要的意义。但是至今为止,科学家对于耳蜗毛细胞分化成熟的分子机制还知之甚少。其中一个主要的原因是因为传统的小鼠模型构建费时费力,通常需要首先构建F0代小鼠,然后进行生殖细胞传代,获得遗传稳定的F1小鼠之后再进行后续的实验。

日前,《Development》期刊在线发表了中科院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室刘志勇研究组题为《嵌合CRISPR-stop技术实现核心基因突变的快速表型分析》的研究论文,该团队发现了一种新型快速鉴定重要基因功能的遗传学方法,运用该方法,能快速进行突变基因的表型筛查。

刘志勇研究组于2018年建立了直接在F0代小鼠中同时敲除三个非致死基因的方法。但是,小鼠约25%的基因纯合突变会导致早期胚胎流产或者出生后致死,该策略并不适用致死基因的突变筛查。解决这个问题的常规策略是利用Cre/Loxp系统进行条件性基因突变,但是更加费时费力。

利用Atoh1验证嵌合型突变方法的可靠性。(A)双报告基因小鼠的模式图。没有cre表达时,所有细胞表达红色蛋白。反之,有cre表达时,细胞关闭红色,开始表达绿色蛋白。(B)二细胞期受精卵的一个细胞注射cre, 内生细胞团(inner cell mass,ICM)和耳蜗(cochlea)同时含有绿色和红色的细胞。(C)Atoh1基因两个高效的sgRNA(1+3)的位置示意图。(D)在二细胞期受精卵的一个细胞内注射cre, 单碱基编辑系统 (BE3) 和 2个针对Atoh1基因的sgRNA(1+3), 直接产生的F0小鼠是嵌合型纯合突变,可以用于快速的表型分析。(E-F) 相对于对照组(E), 嵌合型纯合突变小鼠耳蜗的毛细胞数量显著减少。

如何加速致死基因的表型分析呢?该研究首次尝试在小鼠2细胞期卵裂球的1个细胞内注射单碱基编辑元件和基因特异性的sgRNA,产生嵌合体突变的小鼠,即在该小鼠各个器官内,野生型(没有基因编辑的细胞后代)和纯合突变型(经过基因编辑的细胞后代)的细胞交错分布,这种方法因此被命名为MosaicCRISPR-stop。

利用嵌合型突变方法快速鉴定出Rbm24是维持耳蜗外毛细胞存活的重要基因之一。(A)二细胞期受精卵的其中一个细胞注射更新版本的单碱基编辑系统(hA3A-BE3) 和 Rbm24特异的sgRNA-1,直接产生的嵌合型纯合突变F0小鼠可以立即用于表型分析。(B-C’) 相对于对照组 (B 和B‘), 嵌合型纯合突变耳蜗(C和C’) 的外毛细胞大量死亡。白色箭头所示是残留的、依然表达Rbm24的外毛细胞 (Prestin+)。(D) 跟注射LacZ sgRNA (蓝色)的对照组相比,实验组(红色)的外毛细胞数量显著降低。

该研究首先利用Atoh1基因来检测方法的可行性。Atoh1 -/- 小鼠不能产生耳蜗毛细胞且出生后由于呼吸节律紊乱而致死。结果显示,利用Mosaic CRISPR-stop方法产生的Atoh1突变小鼠的耳蜗毛细胞数量显著减少且该小鼠可以存活到成年。随后,致死基因Sox10突变耳蜗长度缩短的表型也可以被Mosaic CRISPR-stop方法重现。最后,该研究利用此方法探索了Rbm24基因(其突变导致心脏异常和胚胎期死亡)的功能。Rbm24在耳蜗毛细胞高峰度表达,但其功能还完全未知。

利用Mosaic CRISPR-stop方法,作者在8周内快速鉴定出了Rbm24 -/-嵌合小鼠耳蜗的表型为毛细胞大量死亡,这表明Rbm24对于毛细胞的存活发挥了重要的功能。这个表型也可以被传统的Rbm24条件性敲除小鼠模型所重复。值得强调的是:Mosaic CRISPR-stop研究方法不仅适用于听觉系统,也适用于其他器官组织,具有很高的普适性,可以大大加速发育神经生物学领域鉴定基因功能的速度。