东方网3月9日消息：小鼠和人类的听觉系统在发育和功能上十分相似，因此，利用小鼠模型筛查耳蜗听觉毛细胞发育过程中的重要基因，对于毛细胞再生和临床上寻找耳聋基因的治疗靶点有重要的意义。但是至今为止，科学家对于耳蜗毛细胞分化成熟的分子机制还知之甚少。其中一个主要的原因是因为传统的小鼠模型构建费时费力，通常需要首先构建F0代小鼠，然后进行生殖细胞传代，获得遗传稳定的F1小鼠之后再进行后续的实验。
日前，《Development》期刊在线发表了中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室刘志勇研究组题为《嵌合CRISPR-stop技术实现核心基因突变的快速表型分析》的研究论文，该团队发现了一种新型快速鉴定重要基因功能的遗传学方法，运用该方法，能快速进行突变基因的表型筛查。
刘志勇研究组于2018年建立了直接在F0代小鼠中同时敲除三个非致死基因的方法。但是，小鼠约25%的基因纯合突变会导致早期胚胎流产或者出生后致死，该策略并不适用致死基因的突变筛查。解决这个问题的常规策略是利用Cre/Loxp系统进行条件性基因突变，但是更加费时费力。
利用Atoh1验证嵌合型突变方法的可靠性。（A）双报告基因小鼠的模式图。没有cre表达时，所有细胞表达红色蛋白。反之，有cre表达时，细胞关闭红色，开始表达绿色蛋白。（B）二细胞期受精卵的一个细胞注射cre, 内生细胞团（inner cell mass，ICM）和耳蜗（cochlea）同时含有绿色和红色的细胞。（C）Atoh1基因两个高效的sgRNA（1+3）的位置示意图。（D）在二细胞期受精卵的一个细胞内注射cre， 单碱基编辑系统 （BE3） 和 2个针对Atoh1基因的sgRNA（1+3）， 直接产生的F0小鼠是嵌合型纯合突变，可以用于快速的表型分析。(E-F) 相对于对照组（E）, 嵌合型纯合突变小鼠耳蜗的毛细胞数量显著减少。
如何加速致死基因的表型分析呢？该研究首次尝试在小鼠2细胞期卵裂球的1个细胞内注射单碱基编辑元件和基因特异性的sgRNA，产生嵌合体突变的小鼠，即在该小鼠各个器官内，野生型（没有基因编辑的细胞后代）和纯合突变型（经过基因编辑的细胞后代）的细胞交错分布，这种方法因此被命名为MosaicCRISPR-stop。
利用嵌合型突变方法快速鉴定出Rbm24是维持耳蜗外毛细胞存活的重要基因之一。（A）二细胞期受精卵的其中一个细胞注射更新版本的单碱基编辑系统（hA3A-BE3） 和 Rbm24特异的sgRNA-1，直接产生的嵌合型纯合突变F0小鼠可以立即用于表型分析。(B-C’) 相对于对照组 （B 和B‘）, 嵌合型纯合突变耳蜗(C和C’) 的外毛细胞大量死亡。白色箭头所示是残留的、依然表达Rbm24的外毛细胞 （Prestin+）。(D) 跟注射LacZ sgRNA (蓝色)的对照组相比，实验组（红色）的外毛细胞数量显著降低。
该研究首先利用Atoh1基因来检测方法的可行性。Atoh1 -/- 小鼠不能产生耳蜗毛细胞且出生后由于呼吸节律紊乱而致死。结果显示，利用Mosaic CRISPR-stop方法产生的Atoh1突变小鼠的耳蜗毛细胞数量显著减少且该小鼠可以存活到成年。随后，致死基因Sox10突变耳蜗长度缩短的表型也可以被Mosaic CRISPR-stop方法重现。最后，该研究利用此方法探索了Rbm24基因（其突变导致心脏异常和胚胎期死亡）的功能。Rbm24在耳蜗毛细胞高峰度表达，但其功能还完全未知。
利用Mosaic CRISPR-stop方法，作者在8周内快速鉴定出了Rbm24 -/-嵌合小鼠耳蜗的表型为毛细胞大量死亡，这表明Rbm24对于毛细胞的存活发挥了重要的功能。这个表型也可以被传统的Rbm24条件性敲除小鼠模型所重复。值得强调的是：Mosaic CRISPR-stop研究方法不仅适用于听觉系统，也适用于其他器官组织，具有很高的普适性，可以大大加速发育神经生物学领域鉴定基因功能的速度。