为了承认候选成分与ACE2间的相互关系，针对开始发现的8名“种子选手”，研讨团队又进行了三重挑选。
榜首重挑选，研讨团队对候选成分进行了外表等离子剖析（SPR），以验证其对ACE2重组蛋白的亲和力。这一轮中，苦杏仁苷和野黑樱苷锋芒毕露。
平衡解离常数KD值越大意味解离越多，候选成分与 ACE2的亲和力越弱。研讨发现，苦杏仁苷（Amygdalin）和野黑樱苷(Prunasin)具有较强的ACE2结合亲和力，KD 值别离为0.221和0.268 μmol/L。野黑樱苷是苦杏仁苷在体内首要的代谢物，在人血清中的露出量很高。
表1.经过SPR剖析取得的靶向ACE2蛋白的候选活性成分的亲和力。 论文附图
甘草甜素（glycyrrhizin）曾被以为是新冠肺炎的有用医治药物，具有潜在的ACE2结合活性。这项研讨承认了甘草甜素的KD值为4.39 μmol/L。
连翘苷A(forsythoside A)和连翘苷I(forsythoside I)是连翘果实中的首要成分，其对ACE2的亲和力被别离测定为15.8 and 18.7 μmol/L。大黄酸(rhein)是另一种在人血清中高露出的组分，它对ACE2的亲和力适中，KD值为33.3 μmol/L.。
第二重挑选，研讨团队进行了ACE2活性按捺试验，经过ACE2按捺剂挑选试剂盒，测试了候选成分对ACE2活性的影响。成果发现，与ACE2结合亲和力较强的两个组分野黑樱苷(prunasin)和甘草甜素（glycyrrhizin），均未体现出显着的肽酶按捺效果，可是，大黄酸（Rhein）“体现杰出”。
试验发现，大黄酸(Rhein)和大黄素-8-O-β-d-葡萄糖苷（emodin 8-O-β-d-glucoside）具有杰出的ACE2按捺效果，IC50别离为18.33和22.50μmol/L，（如图1C所示）。值得一提的是，大黄酸(rhein)在人体内露出程度高，具有杰出的活性，这阐明其或许是连花清瘟发挥ACE2按捺效果的首要活性成分。
图1.候选成分对ACE2酶活性的按捺效果。（A）阳性药物MLN-4760（B）连翘的候选成分（C）大黄原植物（D）金银花/烤苦杏仁/甘草根论文附图
此外，试验成果还显现，三种连翘苷A、B和I，都具有ACE2按捺效果（如图1B所示），三种绿原酸异构体均体现出中等程度的ACE2按捺活性，IC50都在40μmol / L左右（如图1D所示）。
研讨团队以为，连翘苷A和I，新绿原酸及其异构体，都具有杰出的体外活性，但体内露出低，它们或许与大黄素发挥协同效果。这或许反映了中药的协同效应。
第三重挑选，研讨团队进行了分子对接试验，以研讨6个代表性成分的结合位点。
试验发现，野黑樱苷（prunasin）、连翘苷I（forsythoside I），甘草甜素（glycyrrhizin），大黄酸（rhein），连翘苷A（forsythoside A）和新绿原酸（neochlorogenic acid）这6种具有强亲和力的组分，都能与ACE2和新冠病毒S蛋白结合界面构成恰当的空间互补（如图2A-F所示）。
图2.（A）野黑樱苷、（B）连翘苷I、（C）甘草甜素、（D）大黄酸、（E）连翘苷A、（F）新绿原酸的分子对接成果。 论文附图
此前，大黄酸显现出了最佳的ACE2按捺效果，分子对接则证明其羧基可与要害的肽酶活性位点Ala387结合，构成氢键。在大黄素-8-O-β-d-葡萄糖苷也调查到了相同的状况。
终究，三层挑选悉数射中的4种候选活性成分为，大黄酸，连翘苷A、连翘苷I、新绿原酸及其异构体。
研讨团队总结道，这些成分不仅对ACE2体现出杰出的亲和力，而且能有用地结合到ACE2与S蛋白复合体的触摸面上；经过明显影响新冠病毒S蛋白和人受体ACE2间的结合，其或许发挥按捺新冠病毒的潜在效果，这是避免病毒感染的重要途径。中西医的磕碰，解密连翘与大黄
早在疫后初期，连花清瘟就被使用于新冠肺炎的临床医治，当选中药抗疫的“三药三方”，并被列入《新式冠状病毒感染的肺炎医治计划（试行第四至八版）》。
连花清瘟的组方有13味中药，连翘、金银花、炙麻黄、炒苦杏仁、石膏、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、广藿香、大黄、红景天、薄荷脑、甘草。
