上回说到李自成在战略上的短视，注定了大顺政权不能长久，而吴三桂的反叛，拉开了农民军失败的帷幕。山海关夹在清军和大顺军的对立之间，与南方明朝掌控的区域并不连通，因此吴三桂只能选择投靠一方。一开始吴三桂是决定投降大顺的，因为像唐通之流都封了定西伯，而在明朝时，吴三桂就被崇祯封为平西伯，投降大顺后至少是个侯爵。
同时明朝官员投降大顺也是大势所趋，大顺毕竟是以汉人为主体的政权，1964年3月22日，吴三桂带领部下去北京谒见新主。3月26日，吴军行至离北京不远处的河北玉田县，吴三桂突然改变主意，由投降大顺改为依附大清。吴三桂叛变的主要原因在史籍中说法不一，主要的观点有两种，较为著名的就是因为他的爱妾陈圆圆，另说从北京逃出的奴仆谎报吴父吴襄全家已经被大顺军查抄。
根据大顺军抄家助饷的传统，吴三桂可能认为李自成的召见是一场骗局，亦或是大顺军查抄官绅，自己的利益并不能得到保全。于是吴三桂突然调转兵马，直扑山海关，对刚刚接手防务的唐通发动突袭，唐通兵力不到吴三桂的五分之一，山海关被吴三桂占领。
随着明王朝的衰落与灭亡，辽东的满清并不满足于占领辽东。皇太极病逝，多尔衮摄政，他致书与李自成，扬言要与大顺军同灭明朝、共分天下。但是清军还未发兵，大顺军就已经进入了北京城，虽然失去了共同灭明的企图，但多尔衮势要在明朝灭亡后分一杯羹。于是清廷动员全国十岁至七十岁的男丁参军，除少数留守外，计满洲、蒙古、汉士兵约八万，准备从蓟州、密云破墙而入，避开山海关进取中原。
然而多尔衮行至半路，意外获得吴三桂的使者，带来了求援信函。信中吴三桂要求多尔衮带兵到山海关，与吴三桂合兵“灭流寇于宫廷、示大义于中国”。吴三桂以明朝孤臣的名义请求清军帮助讨伐大顺军，事成之后封疆裂土回报清廷。然而事实上明朝这时候已经不存在，而且吴三桂也没有权利决定割让领土，这种说法只是吴三桂卖国求荣的无耻借口。
多尔衮心知肚明，回信中对吴三桂许以“晋封藩王”，更坚定了吴三桂降清的决心。大顺军主力在李自成、刘宗敏的带领下逼近山海关时，吴三桂再次派人催促多尔衮。多尔衮情知形势严峻，于是下令兼程行进，在距离山海关十里的地方安营扎寨，此时大顺军与山海关守军正在激战。
兵力对比大顺军十万，吴军五万，清军八万，虽然清军的战斗力较强，但只要吴三桂没有降清，大顺与吴军联合，清军是无法入关的，多尔衮最多是像皇太极一样在北京城下逛街抢掠而回。但事实总是残酷的，随着吴三桂的倒戈，形势反而对大顺军不利。
李自成大军4月13日从北京出发，路上遇到吴三桂派来的使者，称吴三桂仍愿意投降。李自成于是派使者到山海关谈判，并放缓了行军速度，大顺军达到山海关的时间晚了三天，中了吴三桂的缓兵之计。4月20日抵达，次日上午大顺军发动总攻，双方激战一昼夜之后，吴军已经出现难以支撑的状况，有的已经开始向大顺军投降。
22日，吴三桂匆忙带领部分士兵与当地官绅出关，请求多尔衮立即参战。经过几天的观察与联络，多尔衮决定出战，并嘱咐吴军系白布于肩，以分辨敌友，同时下令清军进入山海关，对大顺军作战。大顺军虽然拼死抵抗，但攻守易型、败局已定，面对以逸待劳的清军毫无招架之力，李自成决定撤军，撤军途中将吴三桂的父亲吴襄斩首，回到北京后杀掉了吴三桂全家，可见李自成对吴三桂之痛恨。
吴三桂在山海关战役结束之后迅速带领军民剃发易服，多尔衮册封吴三桂为平西王。山海关战役是明清之际最重要的一场战役，决定了是由大顺还是清廷完成对全国的统一。只要将清军拦在关外，大顺军大概率能够完成统一，而清军一旦入关，大顺军挡不住清军的铁骑。战役的结果一目了然，清军获胜，大顺军一败涂地。