博思韦尔伯爵詹姆斯·赫本是玛丽宫廷中，最雄心勃勃的贵族之一，也是最不受欢迎的贵族。所以当玛丽的第二任丈夫达恩利勋爵神秘死亡时，博思韦尔抓住了这个机会。1567年4月，在匆忙与第一任妻子离婚后，博思韦尔和一群人在从玛丽小儿子居住的斯特林城堡返回爱丁堡的路上，遇到了玛丽和随行的皇家随从。于是博思韦尔绑架了玛丽，并强奸了她，强迫她嫁给他。
尽管有些人猜测两人之间可能存在着浪漫的感情，但这桩婚姻震惊了苏格兰贵族，他们不信任博思韦尔，并利用这一事件进一步败坏了玛丽的名声。她与博思韦尔的婚姻，或多或少标志着她统治的结束。要不了几个月，玛丽就会屈服于压力而退位。
在她让位给一岁的儿子后，玛丽被囚禁在洛克利文城堡，一座坐落在湖中央小岛上的小城堡。但是玛丽并不打算在她自己的王国里做一个囚犯。所以她开始策划她的逃跑。在1568年5月2日，玛丽被囚禁了11个月，她让囚禁她的人喝得酩酊大醉，在两个道格拉斯男孩的帮助下，她成功地伪装自己离开了小岛。事实上，她直接从城堡的前门走出来。五一节的庆祝活动，提供了完美的喧闹背景使她能够轻松离开。但是玛丽的自由是短暂的，因为她将在英国的监狱中，度过她的余生。
玛丽被迫退位给尚在襁褓中的儿子詹姆斯后，她南下逃往英格兰。她希望她的表妹伊丽莎白一世会热情的欢迎她，并帮助她夺回苏格兰王位。然而相反的是，伊丽莎白把玛丽囚禁了起来。因为流亡的苏格兰女王对伊丽莎白的宝座存在一定的威胁。所以，面对她苏格兰的表妹带来的威胁，伊丽莎白将玛丽软禁在一座城堡里大约20年。
1587年，伊丽莎白下令处决表妹，这是她光荣统治中最黑暗的时刻之一。具有讽刺意味的是，这对对立的女王将共享永恒的安息：玛丽和伊丽莎白被葬在伦敦威斯敏斯特教堂的过道上。
弗朗西斯沃尔辛厄姆，伊丽莎白的间谍首领，知道前苏格兰女王是他女王的眼中钉。然而，伊丽莎白却不能下令处死同为圣职的女王。因此沃尔辛厄姆需要收集证据证明，玛丽对伊丽莎白的王位构成威胁。机会来了，一位名叫安东尼·巴宾顿的信奉天主教的英国人，正在策划推翻信奉新教的伊丽莎白，用信奉天主教的玛丽取代她。沃尔辛厄姆于是雇了一个双重间谍给玛丽送信，所以这位间谍大师对她的每一件事都了如指掌。当巴宾顿终于找到了玛丽，并得到了她的允许，可以继续进行阴谋时，沃尔辛厄姆抓住了证明玛丽有罪的机会。
24岁的玛丽于1567年7月24日正式退位。她年幼的儿子加冕为苏格兰国王詹姆斯六世，由摄政王统治王国，直到他成年。虽然玛丽还能再活20年，但她再也见不到儿子了。詹姆斯被培养成新教徒，他也从未真正认识自己的母亲，还从自己的导师那里听说，苏格兰赶走自己的母亲是正确的。
玛丽在法国宫廷生活了13年，当她回到苏格兰时，这个国家的宗教面貌已经发生了变化。玛丽在一个信奉新教的国家里是天主教的女王。一位名叫约翰·诺克斯(John Knox)的激进新教改革家，对天主教的玛丽，进行了激烈的抨击。玛丽在她的国家不仅仅是一个政治和文化上的局外人，她也是一个宗教局外人。从她死前几个小时写的最后一封信中可以看出，玛丽似乎把自己看作天主教殉道者。
